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siRNA轉(zhuǎn)染

 更新時間:2022-05-07 點擊量:1378

siRNA轉(zhuǎn)染

1. siRNA導入細胞的方法

siRNA導入細胞的方法有化學轉(zhuǎn)染技術、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術、顯微注射和載體導入技術。技術的選擇要考慮轉(zhuǎn)入時細胞的承受能力細胞對病毒感染的敏感性、細胞生長特性等實驗條件的限制。對于貼壁細胞來講化學轉(zhuǎn)染技術比較合適,而對于懸浮細胞,電穿孔更有效。

2. 轉(zhuǎn)染試劑的選擇

在選擇轉(zhuǎn)染試劑時,首先考慮的是特定的細胞株,而不是被導入細胞中的物質(zhì)。在試劑的選擇上建議選擇線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。

3. 篩選轉(zhuǎn)染試劑

好的轉(zhuǎn)染試劑有以下特點:如下表

特性

程度

實例

毒性

對細胞的毒性小。

轉(zhuǎn)染率

siRNA轉(zhuǎn)染過程中有較高成功

導入效果

準確

mRNA水平檢測siRNA導入的效果比用看家基因的siRNA陽性對照檢測更準確。

4. 細胞在轉(zhuǎn)染過程中死亡的處理方法

如果細胞在轉(zhuǎn)染后大多數(shù)死亡那就說明轉(zhuǎn)染條件不適合細胞生存,需要進行進一步的優(yōu)化。在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時需要考慮因素:轉(zhuǎn)染試劑(線性PEI轉(zhuǎn)染試劑)和細胞特異性條件。例如:siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間、細胞傳代數(shù)和細胞密度等。

 

5. 提高難以轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)染效率的方法以及轉(zhuǎn)染效率的確定

如何提高難轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染效率是目前研究的一個技術題。一般推薦使用電轉(zhuǎn)移法,該方法對細胞的損傷比較大,所以這種方法不太合適。熒光標記siRNA是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞術常用的檢測轉(zhuǎn)染效率的方法。

6. 轉(zhuǎn)染后細胞死亡的原因及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

死亡原因

解決策略

如何優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件:包括轉(zhuǎn)染前調(diào)整細胞密度、轉(zhuǎn)染濃度、檢測時間等。

 

脂質(zhì)體毒性

優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件

轉(zhuǎn)染濃度過高

轉(zhuǎn)染前的細胞狀態(tài)不佳

選擇像線性PEI轉(zhuǎn)染試劑這種毒性小的轉(zhuǎn)染試劑也可以達到優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的目的。外,如果siRNA靶向的基因?qū)S持細胞生長非常重要,那么細胞死亡的現(xiàn)象可能是由基因干擾。如果檢測受到細胞死亡的影響,可以適當調(diào)整檢測時間。


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